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[主观题]
DNA克隆载体上的多克隆位点是为了同时连接多个外源DNA片段。（)
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人类基因组DNA经过Sau3A(G↓ATC)部分酶切后，连接到载体pCU999的BamHⅠ位点上 (G↓GATCC)。BamHⅠ位于多克隆位点的SalⅠ和NotⅠ之间，二者距离20 bp。 (1)从文库中分离出某克隆(克隆1)，分别用NotⅠ(N)、SalⅠ(S)或SalⅠ十NotⅠ(S十N)酶切后，电泳分离并用EB染色。DNA转移到膜上后，用载体上的DNA作为探针进行杂交，结果如下图所示：
1.jpg)
假设同源序列50 bp以下则无杂交信号。在此基因组DNA上标上所有的SalⅠ和NotⅠ位点，标明酶切位点间距离。 (2)从同样的文库中分离到带有重叠片段的克隆(克隆2)，用同样的酶切、电泳、转膜后，以克隆1的DNA为探针(包括基因组DNA和载体DNA)进行southern杂交，结果如下图所示：
2.jpg)
画出克隆2的图，标明所有SalⅠ和NotⅠ位点及位点间距离。 (3)所有的人类基因组DNA都用SalⅠ酶切，并用来自于克隆1或克隆2的DNA为探针作Southern杂交，结果如下图所示：
3.jpg)
其中6个SalⅠ切点的位置可以用以上的结果来确定。请画出这一区域的SalⅠ位点图。
你在一种高效的克隆载体λYES(酵母一大肠杆菌中穿梭)中构建了一个cDNA文库，这种载体是由细菌噬菌体λ基因和一种可在大肠杆菌和酵母中复制的质粒重组而成，它结合了病毒和质粒克隆载体的优点。cDNA可以插入到载体的质粒部分，这样就可以在体外被包装进一个病毒衣壳，包装后的载体感染E.coli比质粒自身更有效，一旦进入E.coli，在λYES中的质粒序列可诱导脱离λ基因组进行重组并可自我复制，这就使cDNA在质粒上与λ分离，这就有利于以后的操作。
为了使克隆效率最大，载体和cDNA均用特殊的方法加以制备，在载体DNA单一独特的XhoI位点切割(5'-CTCGAG)后在dTTP存在下与DNA多聚酶一起孵育，一个制备好的钝端cDNA与一个双链寡核苷酸接头连接，这个接头由两个寡核苷酸5'-CGAGATTTACC和5'-GGTAAATC组成，其5'-末端均有磷酸基团，然后DNA和cDNA混匀并进行连接。这个方案证实非常有效，用2μg载体和0.1mg cDNA，你可以得到4×107重组分子组成的文库。
A.用限制酶消化DNA。
B.把DNA连接入一个载体。
C.在胶上分离DNA片段
D.把DNA片段转移到硝酸纤维素膜上。
E.膜与标记的探针杂交。
试述重组DNA技术中所用的术语：克隆(cloning)和载体(vector或vehicle)。
首先你得切载体DNA，且用碱性磷酸酶去除5'-磷。第二步，把处理过的载体与BamHI切出的cDNA片段混合加入连接酶后温育，连接后将它与感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在含抗生素的固体培养基上，杀死所有未转入载体的细胞，而转入了载体的细胞由于其抗生素抗性而存活下来。
克隆手册上提到了四种对照：①未和连接混合物混合的细菌涂平板；②转入未切过的载体的细胞涂平板；③酶切过但未用碱性磷酸酶去除5'-磷的载体，未加外源cDNA片段但加连接酶温育的混合物与感受态细胞混合涂平板；④载体酶切过，碱性磷酸酶处理过，无cDNA片段加连接酶温育后和感受态细胞混合涂平板。
第一次做该实验的实验组和四个对照组借用同宗的感受态细胞，但所有平板上菌落太多而无法数清(见表16-3-40)。第二次做时，采用自己准备的细胞，但没有一个平板上有菌落长出。你又做了一次，这次的结果见表16-3-40。你从样品中挑了几个菌落，提取质粒DNA后用BamHI处理，有九个菌落生成和线状载体相同大小的一条带，但另三个菌落含有你需要克隆的cDNA片段。
| 表16-3-40 Results of Your cDNA Cloning Endeavor | ||||
| 样品制备 | 实验结果 | |||
| 1 | 2 | 3 | ||
| 对照1 对照2 对照3 对照4 实验样品 | 只有细胞 未切的载体 无磷酸化酶、无cDNA 无cDNA | TMTC TMTC TMTC TMTC TMTC | 0 0 0 0 0 | 0 ＞1000 435 25 34 |
| TMTC=too many to count |
