你正在研究大脑切片中cAMP水平的控制机理,并已证实信号分子如异丙基肾上腺素通过与β-肾上腺素受体的作用,引起cAMP适度增长,这同G-蛋白介导的受体与腺苷酸环化酶间的耦联作用所预期的结果一样。问题在于:异丙基肾上腺素与许多药理试剂间有协同作用,而这些药理试剂本身对cAMP水平元影响,甚至会降低。如何解释这种cAMP水平的反常增加呢?
一位生化学家向你提供了一个可能的解释:他发现在体外实验中,抑制性的三聚G-蛋白的β、γ亚基会刺激Ⅱ型腺苷酸环化酶在脑中的表达。为了验证细胞中的这一发现,计划表达人肾细胞中的cDNAs。而人肾细胞中缺乏在脑中发现的受体。通过这种方式,重现你在大脑切片中观察到的令人迷惑的结果。但在一更简单的背景中,你用Ⅱ型腺苷酸环化酶、多巴胺受体(可与抑制性的G-蛋白相互作用)和αs亚基的各种cDNAs的组合转染肾细胞,得到的细胞在有和无quinpirole存在时分别测量cAMP的含量(quinpirole可激活多巴胺受体),结果见图14-3-11,当然也可检测百日咳菌外毒素的影响。百日咳菌外毒素通过修饰α1亚基而阻塞了从G-耦联受体传来的信号,而α1亚基经修饰后不能再与GTP结合,从βγ亚基上解离下来。
乙酰胆碱作用于毒碱性受体实质上是开放K+通道,因此可减缓心脏的速率。心脏细胞用百日咳菌外毒素处理封闭了这种生理应答,暗示了G-蛋白负责耦联受体刺激通道活性。这个过程能被直接用于研究应用内外膜片钳技术。在这项技术中,一片膜被移液管移出细胞。膜的外表面在移液管中与溶液相连,细胞质表面朝外,以接触不同的溶液(图14-3-16)。受体、G-蛋白和K+通道通过膜片保持联系。K+通道的状况可用测量通过膜的流量来评估。当乙酰胆碱加入到移液管(用正号标明)时,用一完整细胞接触,可用流量表明K+通道是否打开(图14-3-16A)。在相似的情况下,用一片膜插入到盐的缓冲液中,没有流量出现(图14-3-16B)。然而当GTP加入到缓冲液中时,流量恢复(图14-3-16C),接着GTP被除去,停止这种流动(图14-3-16D)。表14-3-16中总结了几组相似实验的结果以检验不同联合组分的影响。
表14-3-16 K+通道对不同实验混合物的反应 | ||||
乙酰胆碱 | 小分子加入到缓冲液 | 纯化的G蛋白成分加入 到缓冲液 | K+通道 | |
1 | + | 没有 | 无 | 关 |
2 | + | GTP | 无 | 开 |
3 | GTP | 无 | 关 | |
4 | GppNp | 无 | 开 | |
5 | 没有 | G蛋白 | 关 | |
6 | 没有 | Gα | 开 | |
7 | 没有 | Gβγ | 关 | |
8 | 没有 | 煮沸的G蛋白 | 关 |
A. 用激光束淬灭质膜上一部分膜受体的荧光素;
B.用紫外光淬灭膜蛋白和膜脂的荧光素;
C. 用紫外光淬灭膜蛋白或膜脂的荧光素;
D. 用激光照射细胞的整个表面, 使荧光淬灭。
G蛋白偶连受体与酶偶连受体(G protein-linked receptors/Enzyme-linked receptors)