为了区别复制和未复制的模板,利用限制性核酸内切酶(DpnI,MboI和ScuBA),它们对于所识别序列GATC的甲基化的敏感性不同(如图13-3-52所示)。这个序列一旦在5SRNA的起始处出现,并且如果DNA在这个位点被切割,转录就不能发生。如果模板在野生型大肠杆菌复制,GATC序列的两条链中的A都被细菌中的Dam甲基化酶甲基化,完全甲基化DNA在体外的复制产生子代双螺旋,在第一轮复制中,只有一条链被甲基化,而在以后的复制循环中DNA就无甲基化。你的想法起始于完全甲基化DNA和诱导它在体外进行复制,然后分析用DpnI处理过的复制DNA上的转录。DpnI只切割未复制的完全甲基化DNA,但是它不能切割复制的DNA。因而它对转录有保护作用。
为了验证方案是否起作用,可构建一个比正常的5SRNA基因略长的基因(大基因),它的RNA转录产物与正常5SRNA基因的转录产物很容易区别(如图13-3-52A所示)。然后将完全甲基化的大基因同甲基化或未甲基化的正常基因混合,在用DpnI、MboI和Sau3A消化前后分别检查它们的转录。限制性内切酶的专一性如图13-3-52A所示。为了验证复制对转录的影响,在完全甲基化的大基因上装配一个转录复合物,诱导复制,并在用限制性内切酶作用前后分别检查转录活性,结果如图13-3-52B所示。
对两个单倍体的面包酵母菌株进行比较,菌株1(交配型α)来自北美,菌株2(交配型a)来自欧洲。用单一的限制性内切酶将DNA线性化后,在凝胶电泳上将DNA分开。菌株1的样品出现两条带,一条很大,另一条很小;菌株2的样品产生两条中等大小的条带。如果运用标准的二倍体出芽方法分析,在二倍体细胞以及细胞所产生的四分子中会得到什么结果(酶切片段是什么样的)?
用一个已从拟南芥克隆的基因作为放射性标记探针,与经过3种不同限制性内切酶处理的卷心菜(同科)DNA样品进行杂交。酶1处理的情况下显示出3条带,酶2处理后有1条带,酶3处理后有2条带。如何解释这一结果?
A.用65℃处理5~10 min使限制性内切核酸酶失活
B. 用CIP处理载体DNA防止自身环化
C. 进行琼脂糖凝胶电泳检测
D. 上述说法都正确
A.必须分离纯化出个体染色体。
B.DNA必须仅从单倍体细胞(基因组)分离,这可避免由于二倍体细胞中同源染色体的存在而引起的模糊信息。
C.必须进行单个染色体分析,这样的分析仅在细胞分裂后期才有可能进行。
D.必须发现一些在染色体上仅有一个切割位点的限制酶。
E.必须先分离核DNA和细胞器DNA,然后用它们来分析个体的图谱。