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[主观题]
试述如何以质粒为载体克隆一个编码植物激素合成酶的基因，并使之在E．coli中表达？应注意哪些问题才
能完成基因的表达？通过哪些途径可提高克隆基因的表达效率？
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质粒pBR607DNA是双链环状的，分子量为2×106U。这个质粒带有两个基因，它们所编码的蛋白质产物使宿主细菌对四环素和氨苄青霉素具有抗性(Tet-r和Amp-r)。该DNA对下列限制酶只有一个识别部位：EcoRI、BamHI、HindⅢ、PstI和SaII。将DNA克隆到EcoRI部位并不影响对两种药物的抗性。将DNA克隆到BamHI、HindⅢ和SaII部位则破坏四环素抗性。克隆到PstI部位破坏氨苄青霉素抗性。用下列限制酶混合物消化可得到如表16-2-10所列的片段。试在限制酶图上标出相对于EcoRI切点的PstI、BamHl、HindⅢ和SalI的切点。
| 表16-2-10 | |
| 酶混合物 | 片段分子量(×106U) |
| EcoRI，PstI EcoRl，BamHI EcoRI，HindⅢ EcoRI，SalI EcoRI，BamHI，PstI | 0.64.2.14 0.2.2.4 0.05.2.55 0.55.2.05 0.2.0.64.1.94 |
试述重组DNA技术中所用的术语：克隆(cloning)和载体(vector或vehicle)。
A.基因载体的选择与构建
B.目的基因与载体的连接
C.重组DNA分子导入受体细胞
D.筛选并克隆含重组体的受体细胞
E.表达目的基因编码的蛋白质
人类基因组DNA经过Sau3A(G↓ATC)部分酶切后，连接到载体pCU999的BamHⅠ位点上 (G↓GATCC)。BamHⅠ位于多克隆位点的SalⅠ和NotⅠ之间，二者距离20 bp。 (1)从文库中分离出某克隆(克隆1)，分别用NotⅠ(N)、SalⅠ(S)或SalⅠ十NotⅠ(S十N)酶切后，电泳分离并用EB染色。DNA转移到膜上后，用载体上的DNA作为探针进行杂交，结果如下图所示：
1.jpg)
假设同源序列50 bp以下则无杂交信号。在此基因组DNA上标上所有的SalⅠ和NotⅠ位点，标明酶切位点间距离。 (2)从同样的文库中分离到带有重叠片段的克隆(克隆2)，用同样的酶切、电泳、转膜后，以克隆1的DNA为探针(包括基因组DNA和载体DNA)进行southern杂交，结果如下图所示：
2.jpg)
画出克隆2的图，标明所有SalⅠ和NotⅠ位点及位点间距离。 (3)所有的人类基因组DNA都用SalⅠ酶切，并用来自于克隆1或克隆2的DNA为探针作Southern杂交，结果如下图所示：
3.jpg)
其中6个SalⅠ切点的位置可以用以上的结果来确定。请画出这一区域的SalⅠ位点图。
有人建议用PCR扩增同该蛋白质结合的微量DNA，思路是(图Q25.8)：①合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体，在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为PCR扩增的引物位点[图Q25.8(a)]；②把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中，转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合；③用转录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸；④用PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。
图Q25.8 用随机的寡聚核苷酸选择和扩增特异的DNA序列(a)用于选择的原初随机序列的寡聚核苷酸，N代表任何一种核苷酸；EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点有利于选择DNA的克隆和序列分析。(b)同序列特异的DNA结合蛋白结合的寡聚核苷酸的选择和序列分析方案按照这一思路，用0.2ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验，这个寡聚核苷酸可以同一个PCR引物结合成部分双链，经过如图Q25.8(b)所示的四轮选择和复制后，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ消化分离到的DNA，将片段克隆到质粒中，并测定了10个独立的克隆(表Q25.1)，问：
表Q25.1 10个克隆的序列
注：画线的序列是PCR引物部位，两种序列都是从BamH Ⅰ末端开始，所有序列中结合位点的方向都是相同的。
A.获得目的基因-重组DNA分子转移如宿主细胞增殖-目的基因与载体基因连接-筛选含重组DNA分子的细胞克隆-扩增目的基因-目的基因表达
B.获得目的基因-目的基因与载体基因连接-重组DNA分子转移如宿主细胞增殖-筛选含重组DNA分子的细胞克隆-扩增目的基因-目的基因表达
C.获得目的基因-目的基因与载体基因连接-重组DNA分子转移如宿主细胞增殖-扩增目的基因-筛选含重组DNA分子的细胞克隆-目的基因表达
D.获得目的基因-目的基因与载体基因连接-筛选含重组DNA分子的细胞克隆-扩增目的基因-目的基因表达-重组DNA
质粒pHUBI DNA是双链环状，长5.7kb(5.7×103个碱基对)。这个质粒带有某基因，它的蛋白质产物使宿主细菌对四环素具有抗性(Tet-r)。该DNA对下列每种限制酶具有一个识别位点：EcoRI、HpaI、BamHI、PstI、SalI、BglII。在BarnHI和SalI位点处克隆会破环四环素抗性；在其他酶的位点处克隆则保留四环素抗性。用各种限制酶以及酶混合物消化可得到如表16-2-11所列的DNA片段。试在pHUBIDNA图上标出所有这些酶的切点。将DNA图画成环形，在圆周上以5.7kb总长标出刻度。
| 表16-2-11 | |
| 酶混合物 | 片段长度(kb) |
| EcoRI EcoRI，BamHI EcoRI，HpaI EcoRI，SalI EcoRI，BglII EcoRI，PstI PstI，BglII BglII，HpaI | 5.7 0.4，5.3 0.5，5.2 0.7，5.0 1.1，4.6 2.4，3.3 1.3，4.4 0.6，5.1 |
