将α-磷酸上标记32P的dATP、dTTP、dGTP和dCTP加入到大肠杆菌可溶性提取液中,温育一段时间。然后用三氯乙酸处理
将α-磷酸上标记32P的dATP、dTTP、dGTP和dCTP加入到大肠杆菌可溶性提取液中,温育一段时间。然后用三氯乙酸处理混合液,使DNA沉淀,但脱氧核苷三磷酸不沉淀。分析沉淀的放射性强度可以测定由前体合成DNA的量。
将α-磷酸上标记32P的dATP、dTTP、dGTP和dCTP加入到大肠杆菌可溶性提取液中,温育一段时间。然后用三氯乙酸处理混合液,使DNA沉淀,但脱氧核苷三磷酸不沉淀。分析沉淀的放射性强度可以测定由前体合成DNA的量。
pXpApYpZ→Xp+Ap+Yp+…
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这样,从Ap、Gp、Cp和Tp得到的放射性标记相对量就分别表示在合成的DNA中二核苷酸ApA、GpA、CpA和TpA的相应频率。在合成反应中用另一种标记的三磷酸,如α-32P-dTTP,则可得到ApT、GpT、CpT和TpT的频率。依此类推,可得到所有16种可能的二核苷酸的频率。对于某一特定的DNA分子,一些最邻近频率为:ApG,0.15;GpT,0.03;GpA,0.08;TpT,0.10。在每种情况下最邻近碱基均按5'→3'方向书写。
用单链环状噬菌体DNA作为模板,有可能在大肠杆菌抽提液中合成前体片段(冈崎片段)。反应所产生的DNA链与环状模板互补,一端带有RNA片段。当用4种α32P标记的脱氧核糖核苷三磷酸进行合成,而产物再降解成3'-核苷酸时,放射性在这4种核苷酸中的分布列入表6-3-25的第一行中。下面4行列入在4种脱氧核糖核苷三磷酸中只有一种是放射性时的结果。
表6-3-25 | ||||
32P标记底物 | 分离的3'-核苷酸 | |||
Ap | Gp | Cp | UP | |
每个生长点片段的32P原子 | ||||
4种核苷酸 dATP dGTP dCTP dTTP | 0.99 0.20 0.72 <0.01 0.08 | <0.01 — — — — | <0.01 — — — — | <0.01 — — — — |
A.第二代
B.第三代
C.第四代
D.第六代
下述精巧的方法曾用来构建不同酶的DNA分子的限制酶图谱。首先,利用多核苷酸酶将噬菌体DNA的5'-末端标记上32P。样品分成两半,每份用酶Ⅰ或酶Ⅱ酶解。两份酶解物分别进行电泳,记下放射性带。这个实验鉴定出末端片段,提供的信息后面有用。该技术的要点是同时利用未标记的和均一标记的DNA样品。未标记样品用酶Ⅰ酶解,进行电泳时采取措施使条带较宽。用标准的溴化乙锭荧光技术定位这些条带,记录它们的位置,将凝胶浸在碱性溶液中使DNA变性,然后将条带转移到硝酸纤维素膜上,得到图16-3-13所示的谱型。32P标记的样品用酶Ⅱ处理、电泳、记录条带位置,将DNA碱变性,然后转移到含酶Ⅰ片段的硝酸纤维素膜上。转移时使弛P条带与未标记的条带成正交,如图6-3-13所示。然后将膜置于复性条件,洗涤,用放射自显影定位放射性。图16-3-13显示每条胶中条带位置(细线)和放射性位置(小圆点)。标有星号的条带是末端片段。试画出每种酶的限制酶图谱。数字表示每个片段的长度(kb),实心圈表示放射性区域。
如果把某细胞染色体上的一分子DNA两条链用32P标记,此细胞连续4次有丝分裂后,含有标记链的细胞占()。
A.1/2
B.2012-1-4
C.2012-1-8
D.:1/16
将正在进行转录和RNA加工的真核细胞与船P标记的ATP温育。那么在成熟mRNA的哪个部位会出现放射性核素?假设32P标记在ATP的(a)α位;(b)β位;(c)γ位。
Hershey和Chase用放射性同位素35S标记噬菌体的(),用32P标记了噬菌体的()。从细菌中释放出的被新复制的噬菌体中只检测到了32P标记的(),而没有检测到35S标记的()。证明噬菌体繁殖时()得到复制并且控制了新()的合成。
图Q2.3研究大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ校正功能的人工底物黑体字母表示被放射性标记的核苷酸
图Q2.4 DNA聚合酶Ⅰ在不含dTTP(a)和含有dTTP(b)时的校正功能
用HindⅢ限制酶处理某DNA大分子,得到一个DNA片段。该酶作用于如图2-3-50A中箭头所示的特定碱基顺序。为测定每条链的顺序,将5'-末端用32P标记(通过多核苷酸激酶催化的反应),再用Maxam-Gilbert序列法测定。切得片段的混合物经电泳后可得到如图2-3-50B所示的图谱(图中迁移方向为自上而下,片段越小移动距离越远)。仔细观察一下电泳图谱,回答下列问题:
①35S不会出现在子代噬菌体中。
②32P总是出现在几个子代的噬菌体中,但是每个噬菌体中的含量比亲代噬菌体颗粒中的含量少得多。35S不出现在噬菌体颗粒中。
③32P只出现在一或二代的噬菌体颗粒中,并只出现在一条DNA链上。35S出现在许多子代在噬菌体中,每个噬菌体的含量比亲代噬菌体颗粒中的含量少得多。